유산균 생균수 측정의 기술적 논쟁과 그 원인(2000년)
한국야쿠르트 중앙연구소 배형석
I. 과거 유산균 수 측정 문제점 평가
1. 문제점
II. 시료 희석
1. 유산균 함유 상품
2. 희석 액 제조
3. 희석 방법
Ⅲ. 배양
1. 통성 혐기성 유산균
2. 절대 혐기성 유산균
Ⅳ. 배지
1. 유산균 배지
2. 배지 성분
Ⅴ. 유산균 염색
1. 그람 염색
2. 그람 염색 변법 I
3. 그람 염색 변법 II
Ⅵ. 현미경 관찰
1. Sample 준비
2. 현미경 사용법
3. 유산균 사진
Ⅶ. 균주 독성
1. 급성 독성 검사
Ⅷ. 참고 문헌
Ⅸ. 기타 (유산균 배지)
I. 과거 유산균 수 측정 문제점 평가
1. 문제점
지금까지 식품공전에 따라 유산균 수를 측정하는 과정에서 1989년에 유산균 희석 액 문제, 1999년에 배지성분 문제로 2건의 사건이 발생하였다. 그 사건 발단과 원인 규명을 통해 식품공전을 개정하게 된 핵심 내용은 표 1에 나타낸 바와 같았다.
표 1 유산균 수 측정의 문제점
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문제점 |
사건 발생 |
문제 원인 |
식품공전 개정 |
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희석 액: 인산완충액 |
1989, . -소비자보호원이 시중에서 판매되고 있는 유산균 제품들을 종류(농후 발효유 7종, 발효유 12종, 유산균 음료 11종) 별로 수거하여 식품공전에 제시한 방법에 따라 유산균 수를 측정한 결과, 유산균 수가 법적 기준에 미달하는 제품들이 많았다.
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-인산완충 액을 시료의 희석 액으로 사용하면 유산균이 BCP 첨가 평판측정용배지에서 37℃에서 72시간 성장하여도 배지에 혼입된 인산의 pH 완충력 영향으로 인하여 황색 집락을 잘 형성하지 못 하였기 때문에 유산균 수가 실제 균 수 보다 현저하게 적게 계수 되는 것으로 확인되었음. |
멸균인산완충희석액 ↓개정 멸균생리식염수 0.1N NaOH→1N NaOH
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배지성분: Peptone L-cystine
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1999, 4. -소비자를 위한 시민의 모임(소시모)이 유통 중인 발효유 제품을 전부 수거하여 한국화학시험연구원에 공식 의뢰, 유산균 수 검사를 시하였음(’98.12). -그 결과 , 식품공전에 제시한 방법에 따라 제조한 BCP배지로는 발효유의 생균 수는 법적 기준(107/㎖) 이상이었으나, 대부분의 농후 발효유의 유산균 수가 법적 기준(108/㎖)에 미달되었다. 그러나 일본에서 수입한 Eiken社 BCP배지로 유산균 수를 검사하였을 때 법적 기준에 미달하는 발효유제품은 없었다(99. 4).
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-Peptone이 BCP첨가 평판측정용배지 성분인 데 현재 10 종류 이상 시판되고 있다. 유산간균은 대부분의 Peptone을 잘 이용할 수 있으나 유산구균은 Phytone Peptone만을 이용하므로 Phy- tone Peptone 외에 다른 펩톤을 첨가한 BCP첨가 평판측정용배지에서 37℃에 72시간 배양할 때 유산간균은 균락을 형성하지만 유산구균은 균락을 형성하지 못하기 때문에 유산구균이 주종인 농후발효유의 유산균 수가 법적 기준에 미달되었던 것으로 확인되었음.
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Peptone pH 6.0～7.0 L-cystine ↓개정․고시(99. 4) Phytone Peptone 다만, 균종에 따라 적정 펩톤을 사용하여야함 pH 6.8～7.0 L-cysteine
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Ⅱ. 시료 희석
1. 유산균 함유 상품
유산균을 함유하고 있는 시판 상품들은 발효유, 유산균 식품, 유산균 정장제, 유산균 사료 첨가제로서 4종류이다. 각 제품 별로 현재 사용되고 있는 유산균 종류들은 표 2와 같다.
표 2 유산균 함유 상품과 사용 유산균 종류
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유산균 함유 상품 |
사용 유산균 |
유산균 수(cells/㎖ or g) |
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발효유 |
L. acidophilus L. bulgaricus L. casei L. rhamnosus. L. delbrueckii Str. thermophilus B. bifidum B. infantis B. longum Lactococcus cremoris |
106～109 |
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유산균 식품 |
Lactobacillus acidophilus Bifidobacterium longum Enterococcus faecium |
107～109 |
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유산균 정장제 |
Lactobacillus acidophilus Lactobacillus sporogenes Entrococcus faecalis Entrococcus faecium Clostridium butyricum Bifidobacterium bifidum Bacillus subtilis Bicillus mesentericus Bacillus polyfermenticus Sacchamyces cerevisiae |
106～108 |
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유산균 사료첨가제 |
Lactobacillus acidophilus Lactobacillus platarum Lactobacillus casei Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Streptococcus bovis Streptococcus thermophilus Bacillus megaterium Bacillus subtilus Bacillus cereus Bacillus coagulans Closridium butyricum Bifidobacterium longum Bifidobacterium animalis Bifidobacterium suis Bifidobacterium thermophilum Saccharomyces cerevisiae |
106～108 |
2. 희석 액 제조
식품공전(한국식품공업협회, 1999)에 의하여(제7.일반시험법 8.미생물시험법 1)일반사항 (3)시액), 미생물의 희석 액으로 멸균인산완충용액과 멸균생리식염수를 사용할 수 있으나, 유산균 수 측정방법에서는 멸균생리식염수를 희석 액으로 사용하여야한다.
1) 멸균생리식염수
8.5g의 sodium chloride에 증류수를 가하여 1,000 ㎖로 하고, 15파운드(121℃)로 15분 간 고압 증기 멸균한다.
[주의사항] 멸균생리식염수를 멸균 시험관에 정확히 9 ml 씩 분주하여야하며, 장기간 보관하였다가 사용할 때에는 증발 여부를 확인 한 후에 사용하도록 한다.
2) 멸균인산완충 희석 액
[국내 식품공전, 1999]
인산2수소칼륨(KH2PO4) 34 g을 증류수 500 ml에 용해하고 1N 수산화나트륨 175 ml를 가해 pH를 7.2로 수정하고 여기에 증류수를 가하여 1,000 ml로 하여 인산완충액으로한다. 이것을 121℃에서 20분 간 멸균한 다음 냉장고에 보존한다. 사용 시에는 이 원액 1 ml를 취하여 멸균 증류수 800 ml에 가하여 희석하고 이것을 멸균인산완충희석액으로 한다.
[미국 Standard Methods - 16th, APHA, 1992]
- APHA에서는 인산염희석액을 기준 희석 액으로 추천함
- IDF/ISO(International Dairy Federation/International Standards Organization)에서는 8 종의 희석액 중에서 Ringer 용액을 추천함(Janus, 1980)
Ringer's solution
Sodium chloride 9.0 g
Potassium chloride 0.42 g
Calcium chloride (anhydrous) 0.24 g
Sodium bicarbonate 0.2 g
D.W 1,000 ml
- 제조방법 -
① Stock phosphate
- 34g의 potassium dihydrogen phosphate를 500 ml의 MS(microbiologicallly suitable) water에 녹인다
- 1N sodium hydroxide 용액으로 pH 7.2로 조정한다.
- MS water로 1ℓ를 �추고 121℃에서 15분 간 멸균 후 4℃에서 보관
② Phosphate dilution water
- 1.25 ml의 stock phosphate를 MS water에 넣어 1ℓ 부피로 맞춘다
- 99 ± 2 ml 또는 9 ± 0.2 ml 부피로 적당한 용기에 분주하고 121℃에서 15분 간 멸균
[주의사항] 희석 액에서 30분 이상 세균을 현탁하고 방치하면 사멸 또는 증식 가능성이 있기 때문에 주의해야한다.
3) 혐기성 희석 액
식품공전에는 표시되어있지 않으나, 유산균 중에서 혐기성 균인 비피도박테리아를 희석할 때에는 혐기성 희석 액을 사용하고 있다.
Buffer solution according to Ochi and co-workers(1964)
Agar 1.0 g
Cysteine hdrochlorid 0.5 g
Potassium dihydrogen orthophosphate, KH2PO4 4.5 g
di-sodium hydrogen orthophosphate, Na2HPO4 6.0 g
Tween 80(sorbitan monoleat) 1.0 g
Water, distilled 1000 ml
pH 6.8
3. 희석 방법
1) 유산간균 및 유산구균의 희석
① 검체 1 g에 멸균생리식염수를 가하여 100 ml가 되게 하고 혼합기에서 혼합․균질한다.
② ①의 검액 1 ml에 희석 액을 가하여 10 ml되게 하여 10-3 검액을 만든 후 동일하게 조작하여 10-4, 10-5, 10-6, 10-7 검액을 조제한다.
③ 각 단계 희석 액 1 ml을 취하여 멸균 페트리 접시에 무균적으로 넣고 약 45℃의 BCP 한천배지 15 ml를 무균적으로 분주한다.
④ 페트리 접시를 조용히 좌우로 회전하여 희석 시료가 골고루 혼합되도록 한다.
⑤ 35～37℃에서 72±3시간 배양한 후 발생한 황색의 집락을 유산균의 집락으로 계측한다.
⑥ 배양 후 균 집락 수를 측정하고 희석 배수를 곱하여 검체 g당 생균 수를 산출한다. 단, 1평판 당 30～300개 집락의 희석 검체만 측정한다. 또, 집락 수가 1평판 당 30～300개의 범위에 있는 희석 검체가 없는 경우에는 희석 배수를 변경하여 재 측정한다.
[세균 수 기재보고]
- 검체 1 ml 중의 세균 수를 기재 또는 보고할 경우에 1 평판의 집락 수는 상당 희석 배수를 곱하며, 동시에 배양 온도를 기록한다.
- 숫자는 높은 단위로부터 3 단계를 4사5입하여 유효 숫자를 2단계로 끊어 이하를 0으로 한다.
2) 비피더스균(Bifidobacterium)의 희석
① 검체 1 g에 10% 탈지분유 희석 액 또는 생리식염수를 가하여 100 ml가 되게 하고 혼합기에 혼합하여 균질한다.
② ①의 검액(10-2용액) 1 ml에 희석 액을 가하여 10 ml되게 하여 10-3 검액을 만든 후 동일하게 조작하여 10-4, 10-5, 10-6, 10-7 검액을 조제한다.
③ 각 희석 검액 0.05 ml 씩을 각각 BL 한천배지 상에 접종하여 멸균 초자 봉으로 도포한다.
④ 멸균 페트리 접시를 혐기성 상자에 넣고 37℃에서 48～72℃시간 배양한다. 배양 후 균 집락 수를 측정하고 희석 배수(X20)를 곱하여 검체 g당 생균 수를 산출한다. 단, 1평판 당 30～300개 집락의 희석 검체만 측정한다. 또, 집락 수가 1평판 당 30～300개의 범위에 있는 희석 검체가 없는 경우에는 희석 배수를 변경하여 재 측정한다.
3) 시료 채취 주의사항
- 수집된 시료는 검사 시까지 0-4℃의 냉장고에 보관하고, 36시간 이내에 검사하여 보관 중에 균 수의 변화가 없도록 해야 한다.
- 액상 시료인 경우에는 강하게 진탕하여 균질한다.
- 고형 및 반 고형인 시료는 균질기를 이용하여 적당량의 희석 액과 혼합하여 균질한다.
- 검체가 불균질한 상태일 때에는 많은 양의 시료를 채취한다.
- 시료 채취 전에 시료를 오염시킬 수 있는 주변의 모든 미생물을 제거시킨다(70% 알콜로 주변 및 사용 기기 살균처리).
- 시료의 채취는 반드시 무균적으로 수행하며, 시료 채취 후 4시간 이내에 검사를 수행한다.
Ⅲ. 배양
1. 통성 혐기성 유산균
① 35～37℃에서 72±3시간 호기 배양한 후에 발생한 집락 중에서 황색의 것만 계수 한다.
- 1평판에 30-300개의 집락이 나타날 수 있는 희석 액을 선택하고 동일 단계의 희석 시료에 대하여 2회 반복한다.
- 통성 혐기성 유산균(L. bulgaricus, L. casei, L. acidophilus, Streptococcus lactis, Str. thermophilus 등)의 수는 BCP한천배지에서 발육시킨다..
- Tween80과 L-cysteine을 첨가하지 않으면 L. bulgaricus는 황색 집락으로 되지 않는 경우가 있다
- BCP 배지에서 발육하지 않는 유산균을 사용한 제품을 검사할 때에는 다른 배지를 사용해야한다.
2. 절대 혐기성 유산균
산소에 의하여 성장이 억제되는 혐기성 유산균(Bifidobacteria)은 배양환경에서 산소를 제거하고 산화ㆍ환원 전위를 낮게 유지해야함
1) Steel wool method(Mitsuoka, 1984)
산성 황산동액에 steel wool(grade 0)을 넣어서 환원 동에 의한 피막이 형성되어 급속히 O2를 흡수함으로써 산화철이 되는 반응을 이용한 방법
① 배지와 미생물을 함유한 petri dish의 뚜껑이 위로 향하도록 rack에 쌓는다.
② 약 30g의 steel wool을 산성 황산동액에 담가 환원 동 피막을 형성케 한다.
산성황산동액 제조 : 60 g의 CuSO4와 20 g의 Tween 80을 정제수 2,000 ml에 용해한다. 여기에 6,000 ml의 정제수와 90 ml의 2N H2SO4를 첨가한다.
③ 핀셋으로 steel wool을 건져 흡수지에 놓고, 배지가 쌓여 있는 rack과 함께 혐기 배양 Jar에 넣는다. 그리고 anaerobic indicator를 넣어 혐기 조건을 확인하기도 한다.
④ 혐기 배양 Jar 안을 진공상태로(60 mmHg) 한 후 진공콕을 잠그고, CO2 개폐 콕을 열어 CO2(700 mmHg)를 주입한다.
⑤ 위 과정(④번)을 2회 반복한 후 최종적으로 혐기 배양 Jar 안을 CO2로 채운다
⑥ 혐기 배양 Jar를 37℃ 배양기에 넣고 48-72시간 동안 혐기 배양한다.
2) 기타
① Anaerobic jar
- 기체 투과성이 낮은 polycarbonate 재질의 jar에 배지를 넣고 배양하는 방법
- Jar 안의 산소를 제거하기 위해 상온에서 산소와 수소가 결합하여 물로 환원시키는 촉매와 수소 또는 수소와 이산화탄소를 발생시키는 시약을 첨가함
- 생산업체 : BBL Microbiology Systems, Fisher Scientic Co., Oxoid 등
② Anaerobic glove box
- 기체가 투과하기 어려운 재질의 플라스틱 또는 금속으로 만든 상자에 air lock, 고무 장갑 등을 설치하고 내부 기체를 수소와 질소 또는 이산화탄소의 혼합물로 대체함
- 생산업체 : Coy Laboratory Products. Inc. 등
③ Hungate's role tube method(Hingate, 1950)
- 혐기적으로 배지를 만들고 고무마개로 밀봉한 시험관이나 vial을 이용하여 배양하는 방법
- 한천배지를 혐기적으로 5-10ml 정도 시험관이나 vial에 분주하고 butyl rubber 마개로 밀봉하여 autoclave한 다음 한천이 굳기 전에 주사기로 시료를 접종함
Ⅳ. 배지
1. 유산균 배지
- 각각의 유산균들은 그룹 별(genus 수준)로 고유한 특성, 즉 당 이용성, 단백질 분해능력, 내산성 정도 등에 차이가 있기 때문에 이들 균주를 배양하고 제품 내 균 수를 측정하기 위해서는 배지 조성을 달리한 선택 배지를 사용하여야한다.
표3 유산균 증식배지와 선태배지
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형태 |
균주명 |
증식배지 |
선택배지 |
|
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L. acidophilus |
MRS, BCP |
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|
L. bulgaricus |
〃 |
LBS |
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L. casei |
〃 |
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단일균주 |
Str. thermophilus |
M17, BCP |
BCP |
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Bif. longum |
BL, MRS |
|
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Bif. bifidum |
〃 |
BS |
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Bif. breve |
〃 |
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Bif. infantis |
〃 |
|
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L. acidophilus |
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MRS-maltose |
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혼합균주 |
Str. thermophilus |
|
BCP |
|
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Bif. longum |
|
BS |
1) Lactobacillus 용 배지
증식 배지 : MRS medium (37℃, 2～3일 동안 호기 배양)
선택 배지 : LBS medium (37℃, 2～3일 동안 호기 배양)
2) Bifidobacteria 용 배지
증식 배지 : BL (37℃, 2～3일 동안 혐기 배양)
선택 배지 : BS (propionic acid와 항생제 사용), NPNL (37℃, 혐기 배양)
기타 당 이용성, 효소를 이용한 집락 구분 방법도 있음
3) Streptococcus thermophilus 용 배지
증식배지 : M17 medium (40～42℃, 1일 동안 호기 배양)
4) Leuconostoc 용 배지
- buttermilk, butter, quarg, cheese 등에 사용
- 증식 배지 : WACCA medium (25℃, 5일 동안 호기 배양) (Galesloot, 1961)
- 선택 배지 : HP medium (streptococci와 구분 가능) (Pearce and Halligan, 1978)
PES medium (isolation from plant materials) (Miyao and Ogawa, 1988)
5) Bacillus coagulans 용 배지
- 증식 배지 : Nutrient agar 등
- 계수 배지 : BCP plate count agar medium(37℃, 2～3일 호기 배양)
방법 : 검체 1g에 멸균 생리식염수를 가하여 100 ml가 되게 하고 혼합기에서 혼합․균질한 후, 집락이 30～300개 나오도록 적당량 희석한다. 위 희석 액을 75℃ water bath에서 30분 동안 방치 후, 1 ml을 petri dish에 넣고 15～20 ml의 BCP agar를 넣는다
6) 발효유제품 내에서의 균수 측정용 배지
- 발효유제품에 사용하고 있는 균주
유산간균 : L. acidophilus, L. bulgaricus, L. casei 등
유산구균 : Str. thermophilus
Bifidobacteria : Bif. longum, Bif. bifidum 등
- 균 수 측정용 배지
국내 식품공전 상에서는 유산균과 비피더스균의 혼합 제품에서 유산균 수와 비피더스균의 시험방법에 따라 시험한 후 유산균 수와 비피더스균 수를 합하여 산출한다. 단, 이 때에 비피더스균의 시험 시에는 BS 배지를 사용한다.
- 법적 기준으로는 각각 균종에 대한 균 수가 아닌 전체 유산균 수를 기준으로 함
표4 유산균수 의 법적 기준(식품공전, 1999)
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유 형 |
법적 기준 (/ml 또는 g) |
비고 |
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발효유 |
1000만 이상 |
유산균수 또는 효모 |
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농후발효유 |
1억 이상 |
〃 |
|
크림발효유 |
1000만 이상 |
〃 |
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발효버터유 |
1000만 이상 |
〃 |
|
농후크림발효유 |
1억 이상 |
〃 |
|
유산균음료 |
100만 이상 |
〃 |
|
유산균식품 |
1000만 이상 |
유산균수 |
2. 배지 성분
1) Nutrients(질소 원, proteins, peptides, amino acids 등)
- Nageli(1880-2)에 의해 ‘peptone'이라고 불리는 단백질 성분의 중요성 발표됨
- 1920년대부터 peptone의 상업적인 공급이 시작
- Peptone의 제조 원료로 meat, casein, soya, lactalbumin, milk, gelatin등을 이용하여 강산 또는 효소에 의한 가수분해로 peptone을 제조
- 제조원료와 가수분해 방법에 따라 단백질(아미노산, peptides), 수용성 비타민, 미량 원소, 탄수화물 등의 함량이 다른 다양한 peptone 제품이 생산되었으며, 미생물마다 제각기 다른 증식효과를 나타냄
2) Carbohydrates(에너지원, glucose 등)
- 미생물의 성장 속도를 증가시키기 위하여 사용되는 에너지 원
3) Essential metals and minerals
무기필수성분으로는 macro-components(mg/L 사용, Na, K. Kl, P, S, Ca, Mg, Fe 등)와 micro-components(ug/L 사용, Zn, Mn, Br, B, Cu. Co, Mo, Sr 등) 있음
4) Buffering agents
- 특정한 pK에서 완충작용을 하는 성분으로 대사 생성물(유기산 등)에 의한 유산균의 저해작용을 억제하는 작용
- 주로 phosphate, acetate, citrate, zwitterion, specific amino acids 등이 많이 사용됨
- 단점으로는 위 성분들이 배지 속의 2가 양이온과 결합하여 필수양이온이 미생물에 의해 이용되는 것을 방해할 수 있으며, 배지를 열처리 또는 장시간 동안 50℃ 이상으로 방치할 경우, phosphate와 금속원소와의 작용으로 배지를 불투명하게 만들며, 특히 phosphate 침전물은 철과 결합하여 철 원소의 이용 가능성을 감소시킴
5) Other components
산화환원 전위을 조정하기 위하여 thioglycollate, cysteine, 또는 ascorbic acid 등이 사용됨
Ⅳ. 유산균 염색
1. 그람 염색
1) 목적 : 세균의 동정 또는 구분에 중요한 지침이 되며, 결과에 따라 그람 양성, 음성으로 분류함. 유산균은 모두 그람 양성
2) 원리 : 그람 양성 균은 teichoic acid를 함유한 세포벽에 1차 염색 액(crystal violet)과 매염제인 iodine의 결합으로 인하여 알콜에 의해 탈색되지 않으며, 그람 음성 균은 1차 염색액이 알콜에 의하여 탈색된 후 대조 염색 액인 safranin으로 염색된다
그람 양성 균 : 청색, 그람 음성 균 : 적색
3) 시판상품 : Difco (3328-32-1), Sigma (HT90-A) 등
4) 염색 순서
① 슬라이드 위에 1～2 방울의 증류수를 떨어뜨리고 관찰하고자하는 검체(균액 또는 집락)를 현탁, 도말하고 자연건조 또는 가열하여 고정시킨다
② Crystal violet 용액을 가하여 약 1분간 반응시킨다.
③ 흐르는 물로 세척한 후 가열, 흡지 또는 자연 상태로 물기를 제거한다.
④ Iodine을 가하여 1분간 반응시킨다.
⑤ 95% 에탄올로 30초간 탈색시킨다.
⑥ 흐르는 물로 세척한 후 가열, 흡지 또는 자연 상태로 물기를 제거한다.
⑦ Safranin O 용액을 약 30초간 처리한다.
⑧ 흐르는 물로 세척한 후 물기를 제거한다.
⑨ 유침하여 현미경하(1,600X)에서 관찰한다.
[주의] 알콜에 의한 탈색시간이 길어지거나, 장기간 배양하여 old cell이 된 경우에 간혹 그람 양성균이 그람 음성 균으로 나타나는 경우가 있다.
2. 그람 염색 변법 I (Hucker 변법)
1) 시약 조제
① 제1 용액 : 0.3g crystal violet을 95% 알콜 20 ml에 용해한 후 증류수로 10배 희석
② 제2 용액 : 0.8g ammonium oxalate을 증류수 80 ml에 용해
③ Lugol 용액 : 2g KI를 5-10 ml 증류수에 용해하고 여기에 요드(I2) 1 g을 혼합하여 용해한
다음, 증류수를 첨가하여 300 ml로 한다.
④ Safranin 용액 : 0.25g safranin을 95% 알콜 100 ml에 용해하여 증류수로 10배 희석
⑤ 95% 에틸 알콜
2) 염색 순서
① 제1 용액과 제 2 용액을 20 ml 씩 혼합한 용액으로 시료를 1분 간 염색
② 물로 세척 후 여지로 물기 흡수
③ Lugoldor으로 1분 간 처리
④ 물로 세척 후 여지로 물기 흡수
⑤ 30초간 알콜 처리하여 탈색시킴
⑥ 물로 세척 후 여지로 물기 흡수
⑦ Safranin 용액으로 10초 간 대비염색
⑧ 물로 세척 후 건조
⑨ 현미경 관찰 : 그람 양성 - 청색, 그람 음성 - 적색
3. 그람 염색 변법 II(Kopeloff 변법)
1) 시약 조제
① 제 1 용액 : 10g의 crystal violet을 증류수 100 ml에 용해
② 제 2 용액 : 50g NaHCO3을 증류수 100 ml에 용해
③ Lugol 용액 : 증류수 25 ml에 4g NaOH 용해하고, 20g Iodine과 1g KI를 첨가하여 용해하고 증류수 975 ml를 첨가하여 혼합
④ Acetone-alcohol : 300 ml acetone과 700 ml ethyl alcohol를 혼합
⑤ Safranin 용액 : 20g safranin을 충분 량의 ethyl alcohol를 첨가하여 용해한 후 증류수 1,000 ml에 맞춤
2) 염색 순서
① 제1, 2 용액을 각각 20 ml씩 혼합하여 만든 alkaline crystal violet 용액을 2분간 처리
② Lugol 용액을 2분간 처리
③ Acetone-alcohol 10여초 간 처리
④ Safranin 용액 30초 간 처리
위 단계별 물로 세척 실시
⑤ 현미경 관찰
Ⅵ. 현미경 관찰
1. Sample 준비 (미생물학 실험, 1987)
1) 슬라이드를 세척 후 건조한다.
2) 슬라이드에 백금이로 증류수 한 방울을 떨군다
3) 백금이를 불꽃에 달군 후 하나의 집락에서 균체를 묻힌다.
4) 백금이에 묻은 균체를 슬라이드 위 물방울과 잘 섞어 얇게 편다
5) 균체 도말을 공기 중에서 건조 후, 불꽃으로 3-4회 통과시켜 열 고정한다.
6) 그람 염색을 한다.
7) 흡지로 잔여 수분을 제거하고 유침한 후 현미경 관찰
2. 현미경 사용법
1) 광학 현미경의 구조
- 대안렌즈(ocular lens) : 배율이 4～30배 짜리 까지 있으며, 대안 렌즈의 배율을 일정하게 두고 대물 렌즈를 바꾸어서 배율을 조정한다.
- 대물 렌즈(objective lens) : 시료에 가까이 위치하는 렌즈이며, 개구 수(NA), 초점 거리, 작동거리가 표시되어 있으며, 저(10X), 중(40X), 유침 고배율(100X)로 구성되어 있다.
- 집광 장치(condenser) : 빛을 모아 대물렌즈와 시료를 통과하는 빛의 양을 많게 하여 상을 밝게하고, 최대 해상력을 얻도록 하는 장치
2) 작동 순서(유침용)
- 현미경의 전원을 켠다
- 유침유 한 방울을 슬라이드(시료) 위에 떨어뜨린다
- 슬라이드를 현미경 받침대 위에 놓는다
- 저배율 대물 렌즈로 적당한 시야를 찾고 집광기 초점을 맞춰 광원이 시료면에 모이게한다.
- 유침용 대물 렌즈(100X)를 위치시킨다 (슬라이드와 닿지 않도록 주의)
- 조동 나사를 움직여 대물 렌즈와 시료의 유침유가 닿도록한다.
- 미동 나사로 초점을 맞추고 접안 렌즈(16X)를 통하여 현미경 관찰(1,600X) 및 사진 촬영
3. 유산균 사진 (1,600 X)
[ 유산간균 ]
[ 유산구균 ]
[ 비피도박테리아 ]
Ⅶ. 균주 독성
발효유 제품에 사용해온 유산균들은 수천 년 동안 음용 해왔기 때문에 인체에 독성이 없는 것으로 인정되고 있다. 이미 상업적으로 사용되고 있는 대부분의 유산균 주들은 표5에 나타난 바와 같이 급성 독성이 없는 것으로 확인되었다. 그러나, 새로 개발될 유산균들은 안전성을 확인하지 않고 사용하기는 어렵고 산업적으로 사용하기 전에 독성과 효능에 대한 사전검사를 해야한다. 그런데, 아직도 유산균의 안전성을 보장해 줄 수 있는 공인된 검사 방법과 기준이 없는 실정이다. 지금까지 유산균의 안전성을 검사하는 방법으로 3가지가 제시되고 있다. 첫째 동물 모델을 이용한 급성 독성시험(한국화학연구소 안전성연구센터), 둘째 사람을 대상으로 PhaseⅠ 임상시험(Tetsuo Taguchi), 셋째 장 세포(Caco-2 cells)에 대한 공격성과 장 점막 손상을 측정하는 시험관 방법이 있다(DC Donohue). 여기서는 일반적으로 유산균의 독성을 검사하는 데 가장 많이 이용되고 있는 동물 모델을 이용한 급성 독성시험에 대해서 주로 설명하고자 한다.
표5 유산균주와 LD50
|
유산균주 |
LD50(g/kg body weight) |
|
Lactobacillus casei YIT9018 Lactobacillus GG(ATCC53103) Lactobacillus acidophilus KY2104 Lactobacillus bulgaricus Lactobacillus fermentum AD002 Lactobacillus helveticus Lactobacillus salivarius AD0001 Streptococcus faecium AD1050 Streptococcus equinus Bifidobacterium longum Bifidobacterium berve HY16 |
>5.00 >6.00 >5.00 >6.00 >6.62 >6.00 >6.47 >6.60 >6.39 25 >2.00 |
1. 급성 독성 검사
1) 실험동물 : SD 계통의 특정 병원균 부재 랫트(5주 령).
2) 시험군의 구성, 투여 농도 및 용량
|
군 |
성별 |
동물 수 (마리) |
투여 액 량 (ml/kg) |
투여 량 (mg/kg) |
|
대조
시험 |
수컷 암컷
수컷 암컷 |
5 5
5 5 |
20 20
20 20 |
0 0
5,000* 5,000 |
* : 경구 투여 급성독성시험에서의 한계용량은 5,000 mg/kg임.
3) 시험물질 투여
- 투여 액 제조 : 유산균을 투여용량에 맞게 측량하여 멸균 생리식염수에 현탁한다.
- 투여 경로 : 동물을 투여하기 전에 하룻밤 절식시킨 후 경구 투여용 금속제 주사침(Sonde)을 이용하여 경구투여 한다.
- 투여 횟수 : 투여 당일 오전에 개체별로 1회 투여한다.
4) 관찰 및 검사 항목
- 일반 증상 및 사망 동물 관찰 :
투여 당일은 유산균 투여 후 6 시간까지 매시간 마다, 투여 2일부터 14일 까지는 매일 일반 증상, 중독 증상, 사망 유무를 관찰한다.
- 체중 측정 : 유산균 투여 개시 전과 투여 후 1, 3, 7, 14일에 체중을 관찰한다.
- 부검 : 전 생존동물을 CO2 가스로 마취 후 개복하여 방혈치사기킨 후 육안적으로 모든 내부 장기를 관찰한다.
참 고 문 헌
1. D.C. Donohue, S. Salminen. 1996. Safety of probiotic bacteria. Asia Pacific J. Clin. Nutr. 5:25-28.
2. DeMan, J.C., M. Rogosa, and M.E. Sharpe. 1960. A medium for the cultivation of lactobacilli. J. Appl. Bacteriol. 23:130-135
3. Galesloot, Th, E., F. Hassing, and J. Stadhouders. 1961. Agar media voor het isoleren en tellen van aromabacterien in zuursels. Neth. Milk Dairy J. 15:127-150
4. Hungate, R.E. 1950. The anaerobic mesophilic cellulolytic bacteria. Bacteriol. Rev. 14:1-49
5. Janus, J.A. 1980. Investigations into the bactericidal effect of diluents applied for the enumeration of Enterobacteriaceae in food products. Report of Group E 50. The Netherlands: International Dairy Federation; 1980. ISO/TC 34/SC 9
6. Mitsuoka, T. 1984. A color atlas of intestinal bacteria. Shobunsha Press. Tokyo.
7. Mitsuoka, T., T. Sega, and S. Yamamoto. 1965b. Eine verbesserte Methodik der qualitativen und quantitativen analyse der Darmflora von Menschen und Tieren. Zbl. Bakt. (1.Abt. Orig.) 195:455-465
8. Miyao, S. and T. Ogawa. 1988. Selective media for enumerating lactic acid bacteria groups from fermented pickles. Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi. 35:610-617
9. Ochi, Y., T. Mitsuoka, and T. Sega. 1964. (Studies on the intestinal flora of chickens. Ⅲ. The development of the flora from chicks till Hens). Zbl. Bakt. (1.Abt. Orig.)193:80-95
10. Pearce, L.E., and A.C. Halligan. 1978. Cultural characteristics of Leuconostoc strains from cheese starters, p.520-521. In: Congrilait 20th International Dairy Congress, Paris, France.
11. Taguchi, T. 1987. Phase Ⅰ Clinical Study of LC 9018. Biotherapy 1(2):278-285.
12. Teraguchi, S., M. Uehara, K. Ogasa, and T. Mitsuoka. 1978. Enumeration of bifidobacteria in dairy products. Jap. J. Bact. 33(6):753-761
13. 식품공전. 1999. 한국식품공업협회
14. 한국미생물학회. 1987. 미생물학실험. 아카데미서적.
15. 한국화학연구소 안전성연구센터, 1997. Lactobacillus acidophilus KY 2104 균주의 렛트를 이용한 단회 경구투여 급성독성시험(시험번호 : S-843). 최종 보고서.
유산균 배지
1) BCP첨가 평판측정용배지(Plate Count Agar with Brom Cresol Purple)
Yeast extract 2.5 g
Peptone 5.0 g
Dextrose 1.0 g
Tween 80 1.0 g
L-Cysteine 0.1 g
Agar 15.0 g
위의 성분에 증류수를 가하여 1,000 ml로 만들고 가열 용해한 다음 pH를 6.0～7.0으로 맞춘다. 여기에 BCP(Brom cresol purple)을 0.04～0.006%가 되도록 가하고 15파운드(121℃)로 15분 간 고압증기멸균한다.
2) BL agar medium (Ochi 등, 1964; Teraguchi 등, 1978)
Lab-lemco powder (Oxoid) 3 g
Liver extract solution 150 ml
Yeast extract (Difco) 5 g
Proteose peptone no.3 (Difco) 10 g
Trypticase (BBL) 5 g
Phytone (BBL) 3 g
Soluble starch 0.5 g
Glucose 10 g
L-CysteineㆍHClㆍH2O 0.5 g
Tween 80(sorbitan monoleat) 1 g
Solution A 10 ml
Solution B 5 ml
Agar 15 g
Solution A:
KH2PO4 25 g
K2HPO4 25 g
in 250ml of distilled water
Solution B:
FeSO4ㆍ7H2O 0.5 g
MgSO4ㆍ7H2O 10 g
MnSO4ㆍ7H2O 0.337 g
Sodium chloride 0.5 g
in 250ml of distilled water
- Liver powder(Kyokuto) 10 g을 170 ml 증류수에 넣고 50～60℃에서 1시간 침출시킨 후 10분 동안 끓인 후 여과하여 사용한다.
위의 성분에 증류수를 가하여 1,000ml로 만들고 가열 용해한 후 pH가 7.2가 되도록 맞춘 다음 15파운드(121℃)로 15분간 고압증기멸균한다. 고압멸균시킨 BL한천 배지를 약 50℃로 냉각시킬 때 소, 말, 양 또는 사람의 탈섬유소혈액을 5%되도록 첨가시켜 멸균 페트리접시에 20ml씩 분주하여 편평하게 한 후 배지표면을 건조시켜 사용한다.
3) BS agar medium (Mitsuoka 등, 1965b)
BL agar 1,000 ml
Sodium propionate 15 g
BS solution 10 ml
BS solution:
Paromomycin sulfate 500 mg
Neomycin 2 g
Lithium chloride 30 g
in 100ml of distilled water
4) MRS medium for Lactobacillus(De Mann et atl, 1960)
Peptone(Oxoid) 10 g
Lab-Lemco beef extract(Oxoid) 10 g
Yeast extract 5 g
Glucose 20 g
Tween 80 1 g
K2HPO4 2 g
CH3COONaㆍ3H2O 5 g
Triammonium citrate 2 g
MgSO4ㆍ7H2O 0.2 g
MnSO4ㆍ4H2O 0.05 g
Distilled water 1000 ml
pH 6.0～6.5
5) M17 broth medium for Streptococcus(Teraghi and Sandine, 1975)
Lactose 5 g
Phytone peptone 5 g
Polypeptone 5 g
Yeast extract 2.5 g
Beef extract 5 g
Ascorbic acid 0.5 g
β-Natrium glycerophosphate(pentahydrat) 19 g
1.0M MgSO4ㆍ7H2O 1.0 ml
Distilled water 1000 ml
pH 7.0
6) LBS (Lactobacillus selection) agar
LBS agar 84 g
glacial acetic acid 1.32 ml
Heat with frequent agitation and boil for 2 minutes
7) WACCA 0.5% medium
Ca-lactateㆍ5H2O 5 g
Casitone 7 g
Yeast extract 5 g
whey 1000 ml
adjust to pH 7.3 with Ca(OH)2
Add 1ml MnSO4 solution (40mg MnSO4ㆍH2O/100ml). Dissolve 15g agar. Clarify with 5g albumin. Sterilize for 15 min 110℃.
- Preparation of Ca-citrate suspension -
Suspend 28g Ca-citrate(Merck) in a 100ml 1.5% carboxymethylcellulose solution, prepared at 45℃. Allow to precipitate for 2 h at 45℃. The supernatant is steamed for 30min.
- Application -
Add 0.3 to 0.7ml Ca-citrate suspension per 15ml WACCA 0.5%(48℃). The amount to be added has to be adapted to the type of starter under investigation.
8) HP medium for enumeration of Leuconostoc
Phytone 20 g
Yeast extract 6 g
Beef extract 10 g
Tween 80 0.5 g
Ammonium citrate 5 g
FeSO4ㆍ7H2O 0.04 g
MgSO4ㆍ7H2O 0.2 g
MnSO4ㆍ7H2O 0.05 g
Glucose (sterilized separately) 10 g
The addition of tetracycline(0.12ug/ml) to the medium selectively inhibits the growth of streptococci, and therefore, allows the direct enumeration of Leuconostoc species in mixed-strain cultures.
9) PES (phenylethyl alcohol surcrose) medium
Trypticase peptone 5 g
Yeast extract 0.5 g
Sucrose 2 g
(NH4)2SO4 2 g
MgSO4ㆍ7H2O 0.5
KH2PO4 1 g
Phenylethyl alcohol 2.5 ml
pH 6.8
10) Nutrient agar
Beef extract 3 g
Peptone 5 g
Sodium chloride 8 g
Agar 15 g
Distilled water 1,000 ml
pH 7.3±0.1
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